Tema 5.8 Técnicas de biología molecular (umh1163) – Transcript

00:02En esta última lección, el A58, Técnica de Biología Molecular, realmente lo que queremos es, tras haber visto no solamente el ADN, sino todo su metabolismo, dar unas nociones de como

00:26la técnica del ADN recombinante ha permitido manejar en el laboratorio el material genético para estudiar condiciones patológicas humanas y también con interés en biotecnología. De todo el temario, inicialmente localizado en el programa, no vamos a dar las interacciones proteína a proteína, puesto que están basadas en la técnica de doble y virón de apadura,

00:50que requiere un gran conocimiento de biología molecular y que si algún alumno está interesado en tener un conocimiento más adecuado de esta técnica, siempre puede remitirse al profesor para una orientación y en todo caso asesoramiento.

01:06Bien, como comentábamos, nos vamos a centrar en el flujo de deformación genética y en las técnicas del ADN recombinante. En la alta de los 70 y tras el empuje que el modelo de Watson y Crick y la posterior demostración por parte de Korber acerca de que la DNA polymerasa es la enzima que realmente ejecuta

01:31la copia de RNA en recombinación, se llegó a un avance en cuanto al conocimiento de cómo no solamente los virus sino también plasmidos o que son cromosomas auxiliares encontrados en bacterias, se puede replicar.

01:50Eso ha llegado a una ampliación y un beneficio en el conocimiento de cómo manejar genomas completos eucarióticos y en mayor desarrollo de todas las técnicas de virgía molecular en avanzar en la historia evolutiva de las proteínas, creación de unas proteínas, etc.

02:09Las técnicas que realmente nos han servido para un importante avance en el campo de la biomedicina, por lo tanto están basadas en el manejo del DNA por muchas veces por organismos evolutivamente inferiores.

02:29De hecho, para manejar el laboratorio del DNA ha sido de gran ayuda el conocimiento de los enzimas de restricción y de cómo cortan el DNA de ferramentos específicos. Bien, ¿Qué son las endonucleas antirrestricciones?

02:45Pues en muchas bacterias, para protegerse del ataque DNA exógeno normalmente vírico, lo que hacen es que tienen en su DNA secuencias que pueden ser reconocidas por endonucleasas y que por lo tanto en principio podrían ser sujeto de corte y de hidrólicis del DNA y para preservar esa secuencia lo que hacen es que lo metilan.

03:11Así cuando se encuentra en una secuencia que no está metilada lo que dan es a destrozar, destruir DNA ajeno y no DNA propio. Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen y cortan una secuencia determinada, regida por unos pares de bases, unos nucleotidos determinados.

03:33Es muy común que estos sitios de cortes tengan una simetría rotacional binaria que actúen como una especie de palíndromes en repetición invertida y el propio no es reconocido pero el exógeno cuando no está protegido por la metilación es objeto de corte.

03:54Bien, el conocer esos puntos de secuencia determinada y las enzimas que lo cortan nos ha permitido utilizar esas enzimas en el laboratorio para manejar nuestro propio DNA y estudiarlo. Cuando queremos estudiar un DNA de una especie determinada lo que hacemos es que lo sometemos a las distintas enzimas y los fragmentos determinantes los podemos separar, bien por el electróforo

04:18de síngel, normalmente es utilizaje de agarosa o más modernamente por técnicas de HIPLF. Por lo tanto somos capaces ahora mismo de trocear de una manera específica el DNA para identificar lo y para manejarlo, bien podemos cortar el DNA pero al mismo tiempo sabemos que existen

04:48enzimas que son capaces de pegar el DNA, por lo tanto estamos en condiciones de manejarlo. Las enzimas que pegan el DNA son las mismas enzimas que utilizamos en el laboratorio que actúan a nivel de recombinación en eucariotas y en procariotas son las ligasas. Por lo tanto estamos en condiciones de si cortamos un DNA introducir antes de volver a ligarlo

05:17un fragmento de DNA exógeno y de esa manera introducir en un vector por ejemplo en un plasmido un DNA exógeno para su replicación, para su producción, para estudio o para su producción masiva, por lo tanto un juego de enzimas de restricciones de ligasas nos permite recombinar artificialmente el DNA. Aquí lo podemos ver de una manera esquemática, si tenemos un vector por ejemplo plasmílico

05:45lo cortamos, introducimos el DNA que queremos replicar, cerramos, obligasas y ya estamos en una condición en la cual hemos introducido en el vector de expresión un DNA específico que nos va a permitir su estudio. De hecho estos vectores de clonación han evolucionado a lo largo de los últimos años desde los vectores más elementales que

06:11son vectores plasmílicos de origen bacteriano cuyo tamaño nos crea una limitación que normalmente no podemos introducir más allá de un único gen o un par de genes porque también es bastante importante introducir un gen de resistencia antibiótico que nos permita seleccionar aquellas bacterias que incluyen el plasmido, aquellas células que introducen el plasmido

06:39pero estamos como decimos con las limitaciones de espacio. Si lo que queremos es contar con más espacio podemos utilizar el lugar de vectores de tipo bacteriano, vectores de tipo vírico, como por ejemplo bacteriófagos modificados en los cuales sustituimos gran parte del DNA endógeno por un DNA fuera ni donde podemos introducir mucho más cantidad

07:04de DNA, muchos más genes. Si queremos aumentar ya nos movemos en cromosomas bacterianos de tipo artificial donde introducimos todas aquellas secuencias del DNA que son necesarias para su replicación pero realmente estamos limpiando el DNA bacteriano de todas sus limitaciones y creando no solamente plasmidos sino

07:28macroplasmidos y si lo que queremos es tener un vector mayor y además un vector que nos sirva para expresión en células eucarióticas en las cuales ocurre modificaciones post tradicionales como la bílicosilación que no ocurre en células procarióticas podemos contar con cromosomas artificiales de tipo levadura, el eucariota, un eucariota primitivo muy utilizado en biología

07:58bien y cómo somos capaces de identificar los distintos fragmentos pues bien los distintos fragmentos los identificamos de una manera muy parecida como se identifica las proteínas, las proteínas se identifican porque tienen anticuerpos que lo reconocen de una manera muy específica, como podemos identificar los trozos de DNA por anticuerpos no lo que utilizamos son los

08:28olivonucleótidos de secuencia complementaria y por lo tanto de una especificidad muy alta unos nucleótidos de tamaño variable pero entre 20 y 50 nucleótidos puede ser un tamaño bastante importante en donde es muy poco probable que esa secuencia específica de amino de nucleótidos contra la que vamos la complementaria se repita en otro trozo de genoma, bien con esa secuencia si lo que tenemos es nuestro olivonucleótido marcado por

08:56ejemplo radioactivamente y separamos los diferentes fragmentos en gel haciendo una incubación con la zona marcada podemos identificar dónde está el fragmento cortar y aislar, de hecho este fue el método que desarrolló alrededor de 1975 Edward Sauber, probablemente el nombre de Sauberblot nos resulte tan común como el nombre de Westerblot que es la técnica que se utiliza en proteína

09:23el nombre de Westerblot de hecho es una deriva de un juego de palabras a través del método originalmente desarrollado por Edward Sauber para identificar DNA, de manera semejante con juego de palabras para identificar RNA se utiliza el Nordblot y en este caso se utiliza con una sonda de olivonucleótidos mientras que obviamente Sauber lo utiliza con desoxid de un nucleótidos, bien si

09:53esa identificación de RNA no la queremos hacer sobre fragmentos ya cortados sino sobre una propia célula o incluso normalmente queremos ver si un RNA se está expresando lo que hacemos es utilizar esa sonda in vivo y introducirlas dentro de la célula electroporando y de esa manera marcamos aquellas células que

10:18están expresando ese RNA podemos al mismo tiempo por técnicas fluorescentes cuantificar y medir la cantidad de expresión esta técnica se llama hibridación in situ si lo que queremos es explorar los niveles de expresión no solamente de un trocito de RNA o de una RNA sino hacer un un cribado mucho más grande un

10:41micro rai lo podemos hacer por modernas técnicas de micro rai en los cuales en superficie de vidrio plástico normalmente silicio lo que se hacen es que se pegan cientos sino incluso miles de pequeñas sondas por lo tanto llevado al extremo en un solo experimento viendo en distintos pocillos cuáles son los niveles de

11:09expresión podemos los niveles de pegada específica a las sondas podemos averiguar los niveles de expresión de distintos tipos celulares estas técnicas son técnicas que a diferencia de proteínas donde su desarrollo todavía no está completamente conseguido ya se están utilizando en el estudio de biomedicina y en el estudio de otras ramas de biotecnología y a una manera muy basiva con laboratorios especializados y por laboratorio de

11:38investigación y ofrece una gran capacidad de estudio simultáneo en un solo paso de expresión de diferentes cantidades de genes bien también podemos manejar el DNA para almacenamiento y para ese almacenamiento podemos construir una genoteca genómica esta genotema genoteca genómica lo que nos

12:06nos permite es que una vez que troceamos el DNA a través de encima de restricción incorporar los vectores de expresión y al mismo tiempo conservarlo en esos vectores de expresión bien por lo tanto podemos diseñar lo que es un genoma típico del mamífero cortado e introducido en estos genomas y lo que hacemos es que para su posterior secuenciación